2.5. Типы световых микроскопов. Развитие световой микроскопии

После выхода в свет последней отечественной монографии по микроскопии /3/ прошло более 30 лет. За это время появилось много новых типов микроскопов, что потребовало изменения в классификации приборов. Наиболее полная классификация современных типов микроскопов изложена в книге /4/. Приведённые принципы классификации соответствуют принятым зарубежными производителями микроскопов, что поможет ориентироваться на современном рынке отечественной и зарубежной микроскопической техники.
Классификация микроскопов связана с классификацией объекта исследования, конструкцией микроскопа, способом освещения объекта и принципом построения изображения.
Первый признак классификации связан с объектом исследования. По этому признаку микроскопы можно разделить на следующие виды:
микроскопы плоского поля - оптическая схема обеспечивает воспроизведение объекта в двухмерном пространстве;
стереоскопические микроскопы - оптическая схема обеспечивает воспроизведение объекта в трёхмерном пространстве.
Второй признак связан с конструкцией микроскопа:
прямые микроскопы - наблюдательная часть микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) расположена сверху объекта;
инвертированные микроскопы - наблюдательная часть микроскопа расположена снизу объекта.
Третий признак связан с построением осветительной системы микроскопа:
микроскопы проходящего света (микроскопы для биолого-медицинских и минералогических исследований) - свет проходит через объект, можно рассматривать прозрачные и полупрозрачные объекты;
микроскопы отражённого света (металлографические микроскопы) - свет проходит через оптическую систему микроскопа (в том числе и объектив как часть осветительной системы), отражается от объекта и вновь проходит через оптическую систему микроскопа (объектив как основной элемент, воспроизводящей увеличенной изображение объекта);
микроскопы падающего света - свет "падает" на объект, минуя оптическую систему микроскопа (объектив), отражается от объекта и проходит через оптическую систему (объектив). В основном - это стереомикроскопы.
Четвёртый признак относится к различным принципам построения изображения. В основном это связано с физико-химическими явлениями, которые возникают при воздействии светового потока на объект. При этом световой поток также может быть подвержен изменению как по форме, так и по своим физическим свойствам:
микроскоп светлого поля - наблюдается на светлом фоне более тёмное изображение объекта; основные условия освещения - прямо проходящий свет, изменения в котором могут быть только связаны с длиной волны осветительного потока, определяемой светофильтром;
микроскоп с методом косого освещения - наблюдается на сером фоне контрастное изображение объекта с неровным по толщине контуром; основные условия освещения - обычный прямо проходящий свет частично перекрывается до того как попадает на объект;
микроскопы с методом тёмного поля - наблюдается на тёмном фоне более светлое изображение объекта или ярко блестящий контур объектов; основные условия освещения - а) в микроскопах проходящего света - обычный прямо проходящий свет полностью перекрывается до того, как попадает на объект; б) в микроскопах отражённого света - обычный свет, проходя через кольцевую диафрагму с непрозрачным диском, по размеру перекрывающим выходной зрачок объектива;
микроскопы с методом фазового контраста (самый популярный микроскоп для биолого-медицинских исследований прозрачных слабоконтрастных объектов) - наблюдается на сером фоне более тёмное "объёмное" изображение объекта, окружённое по контуру светлой полосой. Световые волны, проходящие через полупрозрачный объект (живые или неокрашенные клетки) не теряют интенсивности, а изменяются по фазе в зависимости от показателя преломления объекта и его толщины. Дополнительное фазовое устройство, преобразующее фазовые изменения в амплитудные позволяет увидеть структуру прозрачных объектов 9.
На практике, как правило, не требуются такие узкоспециализированные микроскопы, а проще выпускать один конкретный съёмный узел или дополнительное устройство, которые крепятся по модульному принципу. Например, обе основные осветительные системы могут быть конструктивно объединены, тогда микроскоп становится микроскопом проходящего и отражённого света. Это универсальные микроскопы. Для решения конкретных задач созданы специализированные микроскопы, которые имеют своё название.
Последним достижением в области классических световых микроскопов является создание компьютеризованных микроскопов с моторизованной настройкой механических регулировок. Наибольших успехов в создании такой техники добилась фирма Zeiss. Ей созданы исследовательские универсальные микроскопы Axioplan-2 mot и Axiophot-2 mot. Фирма Nikon также создала компьтеризованный микроскоп Eclipse E1000.
Программное обеспечение и моторизованная механическая часть этих микроскопов дают возможность управлять с помощью компьютера следующими функциями: поднятием/опусканием предметного столика, перемещением предметного столика в горизонтальной плоскости, поворотом револьверной головки с объективами (возможно использование устройства автоматической лазерной фокусировки), регулировкой яркости осветителя, поворотом кольцевых держателей фильтров, регулировкой диафрагм, установкой фокусировки и др.
Развитие науки ведёт к усовершенствованию световых микроскопов, приближая их по разрешению и созданию изображений к электронным микроскопам. В настоящее время серийно выпускается лазерный сканирующий микроскоп, или растровый оптический микроскоп ближнего поля (РОМБП) /5/. Схема его представлена на рис. 14.

Рис. 14. Схема хода лучей в растровом оптическом микроскопе ближнего поля:

1 - объект, 2 - диафрагма с отверстием малого диаметра, 3 - линзы, концентрирующие излучение, 4 - полупрозрачное зеркало, 5 - фотоприемник.

Если локальное освещение объекта осуществлять, пропуская излучение от источника через диафрагму с диаметром отверстия, существенно меньшим, чем используемая длина волны, то в таком устройстве можно достичь разрешения, которое намного ниже дифракционного предела при условии, что расстояние между объектом и диафрагмой будет менее l/2. Сканирование при этом осуществляется перемещением объекта или диафрагмы с поддержание между ними малого зазора.
В основе принципа данного прибора лежит эффект провисания поля через отверстие диафрагмы. Если диаметр последнего гораздо меньше длины волны, то в полупространстве за плоскостью экрана, в котором это отверстие сделано, плотность мощности поля монотонно затухает, заметно спадая на расстоянии, близком к этому диаметру. В РОМБП, работающим на отражение, зондирующее излучение, освещая объект и отражаясь от него, дважды проходит диафрагму.
При создании РОМБП были решены две основные проблемы: изготовление диафрагм с малым диаметром и поддержание малого зазора между диафрагмой и исследуемой поверхностью объекта. В настоящее время разработаны методы получения диафрагм с отверстием 10┘30 нм. Регулирование зазора осуществляется, например, с использованием туннельного эффекта. Экспериментально достигнутое разрешение на РОМБП составляет 20 нм при длине волны 488 нм, т.е. имеет значение, близкое к l/25. Таким образом, растровый оптический микроскоп ближнего поля по разрешению приблизился к растровым электронным микроскопам. Его по праву можно отнести к приборам, имеющим несомненные перспективы для дальнейшего совершенствования и широкого распространения.