2.1. Принцип работы светового микроскопа

Излучением, взаимодействующим с исследуемым объектом и формирующим его изображение, в световом микроскопе является видимый свет с длинами волн меняется от 0,750 мкм для красного цвета и до 0,390 мкм для фиолетового. Возможность получения увеличенных чётких и контрастных изображений элементов микроструктуры материала определяется прежде всего световыми явлениями и оптическими свойствами элементов структуры материала.
Явления преломления и отражения света на границе различных сред описывает геометрическая оптика. Физическая оптика - раскрывает явления интерференции и дифракции света, рассеяния света и др. Физиологическая оптика рассматривает вопросы, связанные с восприятием света человеческим глазом.
Основное назначение микроскопа - расширение предела естественного восприятия глазом мелких объектов. Действие глаза как оптического прибора (рис. 1) сводится к образованию на сетчатой оболочке (ретине) изображения рассматриваемого объекта /2/.

Рис.1. Схема глаза

Это изображение воспринимается зрительными клетками ретины - рецепторами, которые в соответствии с их формой называют палочками, колбочками. Нервные окончания зрительных клеток соединяются в зрительный нерв и выходят из глаза. В этом месте глаза отсутствуют всякие зрительные клетки, и поэтому световые сигналы, попадающие сюда, не вызывают никакого раздражения; это место сетчатки носит название слепого пятна. Однако из-за бинокулярности нашего зрения мы это слепое пятно не замечаем. Действительное перевёрнутое изображение, образованное на сетчатке, посредством зрительного нерва передаётся в мозг, где возникает зрительное восприятие. Благодаря опыту, который накапливается в процессе зрения, этого исключительно сложного и до настоящего времени ещё плохо изученного механизма восприятия, передачи и обработки оптической информации, изображение, образованное на сетчатке, переносится нами на объект.
Способность глаза различать две близкие соседние детали объекта, т.е. его разрешающая сила, или острота зрения, связана со структурой сетчатой оболочки глаза и определяется, прежде всего, размерами зрительных клеток. Если две соседние точки объекта образуют на сетчатке столь малые изображения, что они попадают на одну или даже на две соседние зрительные клетки, то эти точки не вызывают двух отдельных световых раздражения и воспринимаются как одна. (В этом случае говорят, что эти точки не разрешаются). Таким образом, важнейшим условием раздельного восприятия двух точек объекта, считается наличие хотя бы одной нераздражённой зрительной клетки, лежащей между другими клетками, на которые падает изображение (рис. 2).

Рис. 2. Схема определения максимальной разрешающей способности глаза:

С - размер зрительной клетки;
А - расстояние наилучшего видения, А = 250 мм;
В - длина глаза, В = 23,4 мм;
dгл - максимальное разрешение глаза;
aгл - угловая величина максимального разрешения глаза.

При размере колбочек (зрительных клеток) 7 мкм, размер угла a, под которым из зрачка глаза наблюдается расстояние между двумя несмежными зрительными клетками равен:

Анализируя схему глаза (рис. 2) можно сделать вывод, что минимальное расстояние между двумя точками, разрешаемыми глазом, определяется расстоянием от точек до зрачка глаза. В свою очередь, глаз, как оптический прибор, имеет свойство изменять своё фокусное расстояние за счёт изменения формы хрусталика1 - явление аккомодации и, таким образом, влиять на dгл.. В молодом возрасте человек в состоянии аккомодировать на предметы, находящиеся на расстоянии всего 100 мм от глаза. При этом, конечно, глаз сильно утомляется. (У нормального глаза в спокойном состоянии задний фокус совпадает с сетчаткой, и поэтому глаз в этом состоянии резко видит удалённые предметы, т.е. он "аккомодирован на бесконечность"). Без особого утомления глаз может наблюдать предметы, находящиеся на расстоянии примерно 250 мм от него. Это расстояние используется в расчётах оптических приборов и называется расстоянием наилучшего видения. Для этого случая, максимальное разрешение глаза составляет (см. рис. 2):

Для практических расчётов угловое разрешение глаза принимается равным 2'...4', что в линейных величинах разрешение составляет примерно 0,15...0,30 мм.

Действие оптических приборов, вооружающих человеческий глаз при исследовании мелких объектов, сводится к увеличению угла зрения. Увеличение прибора определяется отношением угла зрения, под которым глаз видит предмет с помощью прибора, к углу зрения, под которым рассматривается предмет невооружённым глазом на расстоянии 250 мм. Увеличение угла зрения воспринимается нами как увеличение видимых размеров предмета, поэтому увеличение прибора можно определить как отношение размера увеличенного изображения к истинному размеру предмета.
Лупа является простейшим прибором, позволяющим рассматривать, в отличие от невооружённого глаза, объекты меньшие чем 0,2 мм. Если предмет установить перед собирательной линзой на расстоянии меньшем, чем её фокусное расстояние F, то наблюдатель увидит увеличенное, прямое и мнимое изображение предмета (рис. 3).

Рис. 3. Схема формирование изображения предмета линзой

1- предмет;
2- увеличенное, прямое и мнимое изображение предмета;
3- перевёрнутое, действительной изображение предмета на сетчатке глаза;
F - фокусное расстояние лупы.

Приближение лупы к предмету вызывает приближение изображения, однако при работе с лупой расстояние до изображения не должно стать меньше 250 мм. Увеличение лупы N при расположении предмета на расстоянии А до 250 мм, определяется формулой

N= А/F

Следует отметить, что, чем короче фокусное расстояние F линзы, тем ближе можно ставить предмет, увеличивая тем самым его угловую величину, т.е соответственно разрешение и увеличение лупы. Обычно применяемые лупы имеют фокусное расстояние в пределах 10┘100 мм, давая увеличение примерно до 25 раз. Применение более сильных луп ограничивается возрастанием искажений изображения. Кроме того, при использовании сильных луп зрачок глаза приходится располагать возле самой поверхности лупы и притом весьма точно, а это крайне неудобно. Для получения бoльших увеличений применяется система линз - микроскоп. Это позволяет полностью использовать возможности световой оптики, давая увеличение до 1500....2000 раз.
Микроскоп представляет собой комбинацию двух увеличивающих оптических систем - объектива и окуляра, разделённых значительным расстоянием (рис. 4).

Рис. 4. Принципиальная оптическая схема микроскопа:

1 - объект;
2 - объектив;
3 - действительное увеличенное и перевёрнутое изображение объекта;
4 - окуляр;
5 - глаз;
6 - изображение объекта на сетчатке глаза;
7 - мнимое и перевёрнутое изображение объекта;
А - расстояние наилучшего видения;
-оптическая длина тубуса;
Fоб, F'об - главные передний и задний фокусы объектива;
Fок - главный передний фокус окуляра.

Это расстояние определяет так называемую оптическую длину тубуса - расстояние от заднего главного фокуса объектива до переднего главного фокуса окуляра. Объект 1 располагают вблизи передней главной фокальной плоскости объектива 2 так, что объектив даёт его увеличенное действительное и перевёрнутое изображение 3, которое называется промежуточным. Увеличение объектива определяется

где - оптическая длина тубуса,
Fоб - фокусное расстояние объектива.

Промежуточное изображение 3 располагается в плоскости, близкой к переднему главному фокусу F3 окуляра 4. Окуляр, действуя как линза, даёт окончательное мнимое и перевёрнутое изображение 7 объекта, располагающееся на расстоянии наилучшего видения А от глаза наблюдателя. Увеличение окуляра определяется

где А - расстояние наилучшего видения, А = 250 мм,
- фокусное расстояние окуляра.

Таким образом, в микроскопе предмет увеличивается дважды. Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений объектива и окуляра:

Главное увеличение обеспечивается объективом (оно может достигать 100 раз). Увеличение окуляра составляет 20...24 раза. На рис. 4 объектив и окуляр условно показаны в виде одиночных линз, тогда как на самом деле они представляют собой сложные оптические системы (количество линз в объективе может достигать 14).
Для создания наилучшего изображения важно применять специальные диафрагмы, ограничивающие световые лучи.
Диафрагма, ограничивающая пучок лучей, входящих в систему микроскопа, называется апертурной диафрагмой. Её роль выполняет оправа наименьшей по диаметру линзы объектива или специально регулируемая (ирисовой) диафрагмой осветительной системы 3 рис. 5.
Диафрагма 5 (рис. 5), ограничивающая размер поля зрения называется полевой. Как правило, полевой диафрагмой является диафрагма, расположенная в осветительной системе, ограничивающая размеры освещённой части объекта. Если же размер промежуточного изображения увеличивать путём увеличения размера освещённой части объекта открытием полевой диафрагмы осветителя, то роль полевой диафрагмы будет выполнять диафрагма окуляра.
При работе с микроскопом бывает необходимым изменять степень открытия этих диафрагм. Это желательно делать каждый раз при смене объектива или окуляра.
В связи с использование сильных увеличений в микроскопах приходится для освещения объекта применять специальную осветительную систему, состоящую из источника света и системы линз, которая собирает и направляет свет на объект рис.5.

Рис. 5. Схема осветительной системы:

Источник света 1 проектируется коллектором 2 в плоскость ирисовой апертурной диафрагмы 3, которая линзой 6 изображается в плоскости выходного зрачка 8 объектива 9. Объектив микроскопа в данном случае выполняет роль и конденсора - линзы, позволяющей сфокусировать на объекте изображение источника света - осветительной системы. Отверстие коллектора 2 (собирающая линза) проектируется линзой 4 в плоскость ирисовой полевой диафрагмы 5, а затем линзой 6 и объективом 9 в поле зрения микроскопа на объект 10. Пластинка 7 имеет полупрозрачное покрытие и выполняет роль зеркала: при освещении часть светового пучка направляется в объектив, а другая часть проходит через пластинку и теряется. При наблюдении часть пучка из объектива проходит через пластинку к окуляру, а часть отражается пластинкой и в работе не участвует. На рисунке показан ход лучей только в осветительной системе.
Так как одна и та же осветительная система применяется с различными объективами и окулярами, то для устранения о рассеянного света от частей объекта, не попадающих в поле зрения объектива, необходимо при смене объектива или окуляра: а) апертурную диафрагму, изображение которой при вынутом окуляре видно в плоскости выходного зрачка объектива, открыть так, чтобы ее видимый диаметр был равен диаметру зрачка (чаще несколько меньше: при объективе-ахромате - 1/4 размера изображения диафрагмы объектива, при объективе-апохромате - 9/10 размера диафрагмы объектива) (рис 6,а); б) полевую диафрагму осветителя, края которой видны в поле зрения окуляра, открыть лишь настолько, чтобы диаметр ее изображения был равен диаметру поля зрения, ограниченного диафрагмой окуляра (рис. 6,б).

Рис. 6. Схемы открытия диафрагм осветительной системы:

а - изображение апертурной диафрагмы в выходном зрачке объектива при снятом окуляре: 1 - тубус, 2 - диафрагма объектива, 3 - пучок света, регулируемый апертурной диафрагмой осветителя;
б - изображение полевой диафрагмы осветителя в окуляре микроскопа: 1 - изображение диафрагмы окуляра, 2 - пучок света, регулируемый полевой диафрагмой осветителя;