2.2. Технические характеристики светового микроскопа
Основными техническим характеристиками светового микроскопа являются:
разрешающая способность,
полезное увеличение,
глубина резкого изображения.
Разрешающая способность - это способность оптического прибора различать мелкие
детали. Иными словами - это наименьшее расстояние между изображением двух соседних
точек, которые различаются отдельно. До этого мы рассматривали работу микроскопа
с помощью геометрической оптики, т.е. представляя прямолинейоне распространение
лучей света. При рассмотрении пределных размепров разрешаемых микроскоповь рассмотри
свет с точки зрения физичесвкой оптики, т.е как волну.
Понятие разрешающей способности было введено Эрнстом Аббе, немецким
физиком математиком, который предложил рассматривать малые участки любого объекта
как дифракционную решётку. Тогда изображение, полученное с помощью оптической
системы, есть результат интерференции и дифракции световых лучей на дифракционных
решётках, прошедших через эту систему. и определил разрешающую способность светового
микроскопа. Схематично дифракционная решётка представлена на рис. 7.
При достаточно малой величине d световые лучи заметно дифрагируют
(рассеиваются) на деталях объекта, т.е. огибают эти детали, отклоняясь на значительные
углы (
,
и т.д.) от первоначального направления (рис. 7,а).
Рассеянные на различных деталях объекта лучи пересекаются, накладываются (интерферируют)
между собой. В тех местах, где разность хода лучей равна целому числу длин волн
наблюдается повышение интенсивности света - интерференционный максимум, там,
где разность хода кратна половине длины волны наблюдается гашение интенсивности
света - интерференционный минимум.
Направление дифракционных максимумов определяется соотношением между размером
детали объекта и длиной волны света:
где d - размер детали объекта,
j - угол между направлениями падающего и дифрагированного
лучей,
m - целое число,
l - длина волны света.
Рис. 7. Геометрическое соотношение между постоянной решётки
d, длиной волны l и углом дифракции j.
В качестве примера на рис. 7,б представлена дифракционная картина,
полученная при прохождении лучей света через малые участки поверхности объекта
с размерами деталей d. Стрелками показаны рассеянные на деталях объекта световые
лучи. Луч 0 - направление центрального (нулевого) максимума, т.е. луча, не подвергшегося
дифракции. Лучи -1, +1, -2, +2 - направления дифрагированных лучей, по которым
наблюдаются интерференционные максимумы. Из рис. 6 видно, что в объектив микроскопа
попадают направления интерференционных максимумов нулевого и первого порядков,
а направления максимумов второго порядка не попадают в объектив.
Изображение дифракционной картины, которая получена в результате интерференции
преломлённых световых лучей, можно наблюдать в задней фокальной плоскости F2
объектива (рис. 8). За фокальной плоскостью F2 лучи, соответствующие дифракционным
максимумам, встречаясь, вновь интерферируют между собой и дают промежуточное
изображение самого объекта в передней фокальной плоскости окуляра Fок . Таким
образом, механизм образования изображения в микроскопе представляет собой двухступенчатый
процесс дифракции и интерференции.
На рис. 8 объект представлен рядом деталей, отстоящих одна от другой на расстоянии
d. Объект освещается параллельным пучком лучей вдоль оптической оси системы.
Оправой объектива ограничивается попадание в систему микроскопа центрального
(нулевого) максимума, максимумов первого порядка под углами +
и - для m = +1 и m = -1
и максимумов второго порядка под углами +
и - для m = +2 и m = -2.
Рис. 8. Дифракционные явления при образовании изображения объективом:
F1 - передняя фокальная плоскость объектива, возле которой расположен
объект;
F2 - задняя фокальная плоскость объектива, в которой расположено первичное изображение
объекта (первичная дифракционная картина);
Fок - фокальная плоскость окуляра, в которой расположено промежуточное изображение
объекта;
d - размер детали объекта;
D - размер детали объекта на промежуточном изображении;
I, II, III,... - детали объекта;
I', II', III',...- детали объекта на промежуточном изображении.
Структуру объекта в изображении можно наблюдать только в том случае,
если объектив пропускает хотя бы лучи, дающие интерференционный максимум первого
порядка. В этом случае на второй ступени формирования дифракционного промежуточного
изображения дифрагируют лучи, соответствующие нулевому и первому интерференционным
максимумам. Характеристикой разрешающей способности микроскопа является угловая
апертура a объектива микроскопа, равная половине
полного светового угла, попадающего в объектив. Деталь структуры объекта размером
d разрешается объективом, если угловая апертура объектива равна или больше угла,
определяющего направление первого дифракционного максимума (рис. 9,б,в):
Рис. 9. Схема действия апертуры объектива
0 - направление главного интерференционного максимума;
1,2,3,4 -направления дифрагированных лучей, образующих интерференционные максимумы;
a- апертурный угол объектива;
j- угол между направлениями падающего и дифрагированного
лучей.
а -слишком мелкие детали структуры объекта, не разрешаемые микроскопом (a<
);
б - детали структуры разрешаются микроскопом (a>);
в - действие объектива с более высокой апертурой;
г - действие иммерсии;
д - действие косых лучей;
е - метод тёмного поля.
Таким образом, объектив с угловой апертурой a,
пропускающий интерференционный максимум первого порядка (m= ╠1) позволяет различать
детали структуры объекта размером
Если между объективом и объектом находится не воздух, коэффициент
преломления которого равен 1, а среда с показателем преломления n>1 (рис.
9,г), то в соответствии с законом преломления дифрагированные лучи изменят своё
направление:
где j' - направление интерференционного
максимума первого порядка при прохождении луча света между объективом и объектом
через иммерсию.
Дифрагированный луч при прохождении оптически более плотной среды расположен
ближе к нормали (j'< j)
в n раз. Таким образом, уменьшаются размеры детали объекта в n раз, максимумы
первого порядка которой попадают в объектив, т.е:
Величина A = n sina называется числовой
апертурой - это важнейшая характеристика объектива микроскопа, поскольку она
определяет разрешающую силу объектива.
На корпусе каждого отечественного объектива маркируется числовая апертура: указываются
две цифры после запятой - 0,20; 0,65; 1,25. (Там же маркируется увеличение -
10х, 40х, 100х и характерные потребительские свойства - длина тубуса, тип оптической
коррекции, метод исследования, тип иммерсии, заводской номер и т.д.).
Итак, числовую апертуру объектива можно повысить, если между объектом и объективом
микроскопа расположить специальную среду - иммерсию - с показателем преломления
n > 1. Наиболее распространённой иммерсией для объективов металлографических
микроскопов является кедровое масло.
Условие разрешения (1) выведено для случая освещения объекта параллельным пучком
лучей вдоль оптической оси системы объектива (прямое освещение).
В том случае, когда максимум первого порядка не попадает в объектив из-за его
малой апертуры, следует изменить направление освещающего пучка, дав ему наклонное
направление к оптической оси - косое освещение (рис. 9, д).
На рис. 10 показана разность хода лучей при косом освещении поверхности объекта
с деталями структуры размером d. В данном случае схема на рис. 10 соответствует
отражению падающих лучей от поверхности объекта, т.е. так как это происходит
в металлографическом микроскопе.
В этом случаеа разность хода между лучами будет равна (рис. 10):
Рис. 10. Разность хода лучей при косом освещении:
b - угол падения освещающего пучка
при косом освещении;
j - направление дифрагированного луча, дающего интерференционный
максимум первого порядка;
1 - разность хода
лучей в освещающем пучке, 1
= d sinb;
2 - разность хода
лучей, дифрагирующих под углом j, 2
= d sin j;
- общая разность
хода лучей в направлении интерференционного максимума первого порядка, =1+2
= d (sinb+ sinj).
Для максимума первого порядка (m=╠1)
=l, для случая, когда направление интерференционного
максимума первого порядка j попадает в объектив с
объектив с апертурой a(j
= a) и с учётом применения иммерсии, получим
d =l/n(sinb+
sina).
Угол падения освещающего пучка b не
должен превышать величину апертурного угла объектива a.
Иначе недифрагированный луч (нулевой максимум) не попадёт в объектив микроскопа,
т.е.
. В этом случае разрешающая
способность объектива микроскопа будет выражаться формулой:
d=0,5l/nsina.
В рассмотренных случаях в объектив попадает и участвует в формировании
промежуточного изображения нулевой максимум. Метод микроскопического наблюдения,
удовлетворяющий этому условию, носит название метода светлого поля.
Из приведённых расчётов следует, что при наблюдении в светлом поле при использовании
косого или прямого падающего пучка света наименьшая величина деталей структуры,
разрешаемых объективом, лежит в пределах:
Наличие в структуре объекта более мелких частиц без определения
их размеров, может быть установлено при специальном методе наблюдения, когда
лучи, соответствующие нулевому максимуму, полностью устраняются из поля зрения
и изображение формируется лишь дифрагированными лучами. Такой метод наблюдения
называется методом тёмного поля (рис. 9, е). Этот метод часто используется для
повышения контрастности изображения.
Точный теоретический расчёт предела разрешающей способности светового микроскопа
в каждом случае не имеет практического смысла, поскольку не учитываются многие
факторы: погрешности оптики и юстировки, характер структуры объекта, навыки
исследователя в обращении с микроскопом. Однако можно примерно оценить наименьшее
разрешаемое расстояние.
Половина полного угла a попадающего в объектив света
современных объективов не превышает
,
показатель преломления иммерсии при использовании кедрового масла n = 1,515,
длина волны белого света l
0,55
мкм, тогда:
Полезное увеличение.
Чтобы полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо
иметь соответствующее увеличение всей системы микроскопа. Это увеличение должно
быть настолько большим, чтобы величина изображения детали объекта d - наименьшего
разрешаемого микроскопом расстояния - не была меньше разрешающей способности
глаза наблюдателя dгл на расстоянии наилучшего видения. Такое увеличение микроскопа
принято называть полезным увеличением (
).
Как известно, предел разрешения глаза практически принимается равным 2'┘4' (0,15┘0,30
мм) (см. расчёт в п.1.1.) и полезное увеличение равно:
Увеличение =
500 А представляет собой нижний предел полезного увеличения, так как меньшее
увеличение не позволит различить все детали объекта, изображение которых формируется
объективом с апертурой А. Увеличение, превышающее 1000 А, является "бесполезным",
поскольку оно не даёт каких-либо новых деталей в изображении объекта. Поэтому
увеличение = 1000 А называют
верхним пределом полезного увеличения.
Перед исследованием структуры объекта необходимо так выбрать объектив и общее
увеличение микроскопа, чтобы обеспечить разрешение интересующих деталей объекта.
Для этого прежде всего устанавливают полезное увеличение микроскопа по формуле
где 
- размер
интересующей детали объекта.
Исходя из необходимого полезного увеличения определяют числовую апертуру и выбирают
объектив, а затем и окуляр, учитывая общее увеличение микроскопа.
Пример: предположим требуемое полезное увеличение =600,
исходя из формулы предела верхнего полезного увеличения А=0,6. По данной апертуре
выбираем объектив: х40, А =0,6. Для получения требуемого полезного увеличения
выбираем окуляр х15, и тогда 40 х 15 =600.
Глубина резкого изображения - это расстояние вдоль оси зрения, на протяжении
которого изображение объекта при сфокусированной системе микроскопа будет выглядеть
резко и чётко.
Глубина резкого изображения в плоскости объекта зависит от апертуры объектива
и длины волны падающего света. Если принять в качестве увеличения микроскопа
нижний предел полезного увеличения 500 А, то /3/:
Например, для объектива с числовой апертурой 0,65 и белого света
глубина резкого изображения в плоскости объекта (глубина резкости объектива)
равна 0,65 мкм.